強直性脊柱炎（AS）是一種全身性炎癥性疾病，據報道中國人群的患病率為0.29%。強直性脊柱炎可能造成不可逆的骨骼結構損傷和殘疾，導致疲勞、睡眠障礙、精神疾病等，最終致使患者生活質量下降，并給醫療保健系統和社會帶來巨大的經濟壓力。強直性脊柱炎疾病活動度指數（BASDAI）是衡量強直性脊柱炎疾病活動的常用指標，但由于其主觀性和患者驅動的性質，存在一定局限性。現階段關于強直性脊柱炎潛在生物標志物的蛋白質組學研究仍然有限，該領域的進一步探索對于了解強直性脊柱炎的發病機制以及確定新的診斷和治療策略至關重要。
2025年5月，中國中醫科學院廣安門醫院劉宏瀟團隊與國家蛋白質科學中心馬潔團隊在Journal of Advanced Research（IF=11.4）期刊上發表題為“Characterization of immune features and discovery of potential biomarkers for ankylosing spondylitis using deep plasma proteomics”的最新研究成果，利用深度血漿蛋白質組學描述免疫特征并發現強直性脊柱炎的潛在生物標志物。
北京青蓮百奧生物科技有限公司為該研究提供基于MagicOmics DMB低豐度蛋白富集磁珠試劑盒的深度血漿蛋白質組學檢測服務。
研究首先對發現隊列（n=104，包括活動期強直性脊柱炎患者，n=48；穩定期強直性脊柱炎患者，n =21；健康對照者，n=35）進行血漿蛋白質組學分析，根據血漿蛋白質組學數據研究強直性脊柱炎的免疫特征和功能障礙；之后通過結合隨機森林算法（RF）和正交偏最小二乘判別分析（OPLS-DA），構建機器學習模型驅動的評分矩陣，發現蛋白質SAA1、FERMT3、ILK、TLN1可作為強直性脊柱炎的潛在生物標志物；最后，在驗證隊列（n=79，包括活動期強直性脊柱炎患者，n=27；穩定期強直性脊柱炎患者，n=28；健康對照者，n=24）中通過ELISA實現驗證。
圖1 強直性脊柱炎深度血漿蛋白質組學和生物信息學分析工作流程
值得一提的是，本研究的血漿蛋白質組學分析使用青蓮百奧自研MagicOmics DMB低豐度蛋白富集磁珠試劑盒實現前處理，采用數據非依賴性采集（DIA）模式進行質譜檢測，最終共鑒定到3891種蛋白質，蛋白質豐度分布達7個數量級，體現了血漿蛋白質組的深度覆蓋。
強直性脊柱炎是一種與免疫性疾病密切相關的疾病，多種免疫細胞和炎癥介質對其發病機制有顯著影響；本研究根據血漿蛋白質組學數據通過CIBERSORT方法計算免疫細胞類型和比例，進而描述強直性脊柱炎患者的免疫學特征。
結果表明，記憶B淋巴細胞、M2型巨噬細胞、靜息記憶CD4+ T細胞和初始CD4+ T細胞的比例在三組之間存在顯著差異。與健康對照者相比，在活動期強直性脊柱炎患者中觀察到靜息記憶CD4+ T細胞數量顯著增加；在穩定期強直性脊柱炎患者中觀察到M2型巨噬細胞數量增加，表明其在強直性脊柱炎穩定中的潛在作用。
圖2 基于血漿蛋白質組學數據的強直性脊柱炎免疫特征
與健康對照者相比，在活動期強直性脊柱炎患者中確定了376個差異表達蛋白質（DEP）。分析表明，203個上調蛋白質主要參與凝血、肌動蛋白絲組織、傷口愈合以及白細胞遷移等功能，173個下調蛋白質主要參與代謝過程、RNA加工、運輸和定位以及翻譯等功能。
圖3 活動期強直性脊柱炎患者和健康對照者的蛋白質組學特征和功能分析
對這376個差異表達蛋白質進行k-means聚類表達趨勢分析，在健康對照者、活動期強直性脊柱炎患者、穩定期強直性脊柱炎患者三組中揭示了四簇不同的聚類。其中：
簇1包含在活動期強直性脊柱炎患者中相比健康對照表達下調，但在穩定期強直性脊柱炎患者中恢復的蛋白質，主要富集于胰高血糖素信號通路、丙酮酸代謝和糖異生，這部分蛋白質的相關功能在活動期強直性脊柱炎患者中可能喪失；
簇4包含在活動期強直性脊柱炎患者中相比健康對照表達上調，但在穩定期強直性脊柱炎患者中恢復的蛋白質，主要富集于肌動蛋白細胞骨架的調節、黏著斑和趨化因子信號通路，這部分功能蛋白質的失調可能與強直性脊柱炎的病理進程相關；
簇2/簇3代表在活動期強直性脊柱炎患者中表達下調/上調，但在穩定期強直性脊柱炎患者中未能恢復到健康對照水平的蛋白質，主要富集于剪接體和核糖體通路/血小板活化、緊密連接等方面。
圖4 強直性脊柱炎不同階段的蛋白質組學特征
基于376個差異表達蛋白質構建了隨機森林算法（RF）機器學習模型，用于區分強直性脊柱炎患者與健康對照者。模型以隊列70%的樣本為訓練集，30%的樣本為獨立測試集，執行五折交叉驗證?；煜仃囷@示，模型具有高精準度和理想召回率，強直性脊柱炎患者100%被準確預測為陽性病例，健康對照者91%被準確預測為陰性病例。模型的受試者工作特征（ROC）與精確率-召回率（PR）曲線下面積（AUC）分別達0.926與0.918，表明其能精準區分陽性與陰性病例，并以出色的準確性預測陽性結果。
圖5 構建基于隨機森林算法的模型區分強直性脊柱炎患者與健康對照者
首先，對基于隨機森林算法的模型的分類準確率與基尼重要性進行排名，并將其映射到[0,5]的分值區間；之后，使用正交偏最小二乘判別分析，計算每個差異表達蛋白質在區分活動期強直性脊柱炎患者與健康對照者時的變量投影重要性（VIP）得分，并將VIP值排序并映射到[0,5]的分值區間，根據不同的閾值標準對其相應的校正后p-value進行劃分并予以0-5的賦分；此外，將log2|FC|（以2為底的差異倍數絕對值的對數）排序并映射到0-5的分值區間，同樣根據不同的閾值標準對其相應的校正后p-value進行劃分并予以0-5的賦分；最終，整合上述所有評分參數構建生物標志物的評分矩陣，該矩陣中的平均得分指示每個蛋白質在區分強直性脊柱炎患者與健康對照者時的重要性。
圖6 使用基于機器學習的評分矩陣識別強直性脊柱炎的潛在生物標志物
結合評分矩陣、功能分析和強直性脊柱炎不同階段蛋白質表達趨勢，確定蛋白質SAA1、FERMT3、ILK、TLN1作為強直性脊柱炎候選生物標志物。蛋白質SAA1、FERMT3、ILK、TLN1在活動期強直性脊柱炎患者中的表達水平均升高，在穩定期強直性脊柱炎患者中恢復正常水平，表明其可用作強直性脊柱炎的診斷和預后生物標志物。SAA1、FERMT3、ILK、TLN1預測強直性脊柱炎患者區分于健康對照者的判別效率分別為0.745、0.880、0.815、0.851；預測強直性脊柱炎從活動期到穩定期的判別效率為0.719、0.813、0.850、0.851，普遍高于ESR（紅細胞沉降率，客觀炎癥標志物）的判別效率，與CRP（C-反應蛋白，客觀炎癥標志物）相當或與之相比略高。
對驗證隊列（n=79，包括活動期強直性脊柱炎患者，n=27；穩定期強直性脊柱炎患者，n=28；健康對照者，n=24）的血漿樣本進行ELISA驗證。觀察到蛋白質SAA1、FERMT3、ILK、TLN1在三組間的表達趨勢與蛋白質組學分析結果一致。利用這四種蛋白質構建組合模型，進一步使用ELISA數據對其進行驗證，結果表明，該模型能有效區分活動期強直性脊柱炎患者與健康對照者。這體現了通過基于血漿蛋白質組學的評分矩陣篩選出的強直性脊柱炎生物標志物具備作為潛在藥物靶點以及疾病判別候選標志物的潛力。
本研究提出了一種新策略，通過將蛋白質組學分析與基于機器學習的方法相結合，闡明強直性脊柱炎的病理機制并發現了生物標志物，并探索潛在治療靶點。通過對不同階段的強直性脊柱炎患者進行深度血漿蛋白質組分析，觀察到幾種蛋白表達水平的動態變化，這些蛋白質體現強直性脊柱炎的進展，并與其病理機制相關。最終，通過ELISA驗證蛋白質SAA1、FERMT3、ILK、TLN1可作為強直性脊柱炎的潛在生物標志物。其中，FERMT3、ILK、TLN1參與整合素通路，該通路對細胞粘附和遷移、信號轉導以及與細胞外基質的相互作用至關重要，表明其可能與在強直性脊柱炎中觀察到的炎癥反應有關。整合素通路中的相關分子可能作為強直性脊柱炎的潛在治療靶點，需要進一步研究。
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